- 李卓航;王栋;王艳秋;戚明珠;黄荷兰;林娜;苏晓慧;孔祥英;
以核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)/趋化因子C-X-C-基元受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)通路为切入点，探讨川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)干预大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠脑内神经干细胞(neural stem cells, NSCs)迁移的作用机制。SD大鼠分为假手术组、模型组、TMP 20 mg·kg~(-1)组和TMP 40 mg·kg~(-1)组；通过神经功能缺失评分评价神经功能损伤；免疫荧光法检测脑组织5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine, BrdU)/双皮质素(doublecortin, DCX)双标细胞；观察TMP对C17.2细胞迁移的影响；蛋白免疫印迹法检测脑组织和C17.2细胞中Nrf2、HO-1、p62、醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1]、基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)、CXCR4蛋白表达。结果显示，大鼠脑缺血7、21 d后，神经功能损伤评分及BrdU~+/DCX~+细胞显著升高，脑组织中Nrf2及CXCR4表达均显著升高；与模型组相比，TMP 40 mg·kg~(-1)可显著降低神经功能评分，进一步升高BrdU~+/DCX~+细胞数量及Nrf2、CXCR4及SDF-1表达；此外TMP可以显著促进C17.2细胞迁移，且时间以及剂量依赖性提高p62、Nrf2、HO-1、NQO1表达，TMP 50μg·mL~(-1)给药12 h表达量最高(P<0.01)。综上，TMP可通过活化Nrf2/HO-1/CXCR4通路，促进NSCs迁移从而发挥抗缺血再灌注损伤作用。该研究为TMP在缺血性脑卒中疾病中的应用提供了实验支持。
2024年09期 v.49 2308-2315页 [查看摘要][在线阅读][下载 635K] [引用频次：9 ] |[下载次数：961 ] - 戚明珠;王艳秋;王栋;李卓航;黄荷兰;林娜;苏晓慧;孔祥英;
该文旨在研究川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)联合神经干细胞(neural stem cells, NSCs)移植对大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠的干预作用，并基于干细胞生物学行为调控探讨TMP联合NSCs移植对缺血性脑卒中的作用机制。将MCAO大鼠按神经功能评分随机分为模型组、TMP组、神经干细胞移植(NSCs)组和TMP联合神经干细胞移植(TMP+NSCs)组，同时设立假手术组。以神经功能评分来评价TMP联合NSCs移植对MCAO大鼠神经功能的改善情况；分别以BrdU、BrdU/DCX、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP免疫荧光标记法评价NSCs的增殖、迁移、分化情况；蛋白免疫印迹检测基质细胞衍生因子1(SDF-1)、趋化因子C-X-C-基元受体4(CXCR4)的蛋白表达及氧化应激通路核因子E2相关因子2(Nrf2)、胞浆蛋白伴侣分子1(KEAP1)、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)的蛋白表达，研究TMP联合NSCs发生迁移的作用机制。结果发现，TMP联合NSCs移植可以显著改善MCAO大鼠神经功能评分；免疫荧光染色结果显示TMP组、NSCs组、TMP+NSCs组的BrdU~+、BrdU~+/DCX~+、BrdU~+/NeuN~+、BrdU~+/GFAP~+细胞数均明显升高，且以联合治疗组最明显；进一步的蛋白免疫印迹结果分析发现TMP组、NSCs组、TMP+NSCs组的CXCR4蛋白表达均显著升高，Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表达上调，KEAP1蛋白表达降低。该研究表明TMP以及NSCs移植均可促进NSCs增殖、迁移和分化，进而促进神经功能恢复，两者联合作用更佳，其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1/CXCR4通路有关。
2024年09期 v.49 2316-2325页 [查看摘要][在线阅读][下载 843K] [引用频次：7 ] |[下载次数：574 ] - 李卓航;戚明珠;黄荷兰;苏晓慧;孔祥英;
基于“药对-疾病”关联网络，探索黄芪-川芎(芪芎)药对改善气虚血瘀治疗缺血性脑卒中的作用特点及二者配伍机制。通过中药系统药理分析数据库(TCMSP)、SwissTargetPrediction数据库筛选芪芎药对的有效成分并预测候选靶标；检索人类基因(GeneCards)、DrugBank、在线人类孟德尔遗传(OMIM)及药物靶标(TTD)等数据库获取缺血性脑卒中的相关基因靶标；通过STRING与Cytoscape 3.9.1软件利用病证相关基因和药对候选靶标的相互作用信息构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络，根据网络拓扑特征值筛选核心靶点；并基于Metascape平台和DAVID数据库整合生物分子相互作用信息，进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析及生物功能挖掘，进一步探索芪芎药对作用机制及配伍特点。结果显示，候选生物学过程主要涉及免疫调节、血液循环调控、神经递质调控、氧化应激调节等功能模块，富集于血脂与动脉粥样硬化、钙信号通路和血小板活化等通路。且黄芪和川芎作用特点各有侧重，黄芪主要维持机体免疫平衡和生长因子调控反应，川芎则重在改善循环系统并参与激素代谢功能，提示芪芎药对多靶点、多途径协同治疗缺血性脑卒中的配伍机制。进一步通过实验验证，发现芪芎药对可显著下调关键靶点TLR4、NF-κB、IL-1β、F2R、PLCβ1和MYLK的表达。该研究初步揭示芪芎药对可能通过矫正免疫失调、血液循环障碍及炎症反应以发挥活血行血、益气清络的精气血三补功效，进而为其后续改善气虚血瘀治疗缺血性脑卒中的临床研究提供了支持，也为中药“相须”七情配伍的现代生物学内涵解析提供新思路。
2024年09期 v.49 2326-2335页 [查看摘要][在线阅读][下载 881K] [引用频次：9 ] |[下载次数：1318 ] - 戚明珠;李卓航;黄荷兰;祝盼盼;朱鏐娈;林娜;苏晓慧;孔祥英;
旨在优选体外诱导中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)形成的条件，以建立相对稳定的实验技术平台。通过比较不同条件，包括大鼠和小鼠等常用的实验动物，利用percoll密度梯度离心法分离骨髓中性粒细胞、外周血中性粒细胞等多种细胞来源，采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)不同诱导剂体外诱导，通过MPO/CitH3/DAPI免疫荧光标记法以及细胞培养上清游离DNA(cell free DNA,cfDNA)含量检测综合评价，筛选体外诱导NETs形成的优选条件；在上述平台选择基础上，进一步通过给予中药有效单体川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)进行验证，综合评估优选的体外NETs诱导条件的稳定性。结果显示，包被多聚赖氨酸可一定程度促进小鼠骨髓中性粒细胞NETs形成。LPS和PMA均可显著促进小鼠骨髓中性粒细胞MPO、CitH3蛋白表达，并提高大鼠外周血中性粒细胞培养上清中cfDNA含量；且与LPS相比，PMA诱导cfDNA水平升高更显著(P<0.05)。与PMA共孵育后小鼠骨髓中性粒细胞、大鼠骨髓中性粒细胞和大鼠外周血中性粒细胞中MPO、CitH3蛋白表达均显著升高，以大鼠外周血中性粒细胞升高最明显。TMP可以显著下调PMA诱导的大鼠外周血中性粒细胞中MPO、CitH3和NE蛋白的表达。综上，PMA诱导大鼠外周血中性粒细胞是体外诱导NETs形成的较优条件。该研究为基于NETs的体外研究提供优选平台，并为以调控NETs为靶标的中药作用研究提供前期基础。
2024年09期 v.49 2336-2344页 [查看摘要][在线阅读][下载 595K] [引用频次：3 ] |[下载次数：1181 ]
- 周凤玲;袁彬;叶一娴;邓舒烨;马静;刘红;马远征;韦燕飞;
基于CKB/p53信号通路研究白花丹醌对人肝癌Huh-7细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。将白花丹醌1～12μmol·L~(-1)处理Huh-7细胞，进行细胞增殖和活性cell counting kit-8(CCK-8)实验，确定1、3、6μmol·L~(-1)为低、中、高浓度用于后续实验。采用规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)-9基因编辑技术敲除Huh-7细胞中的脑型肌酸激酶(creatine kinase, brain type, CKB)基因；CKB过表达慢病毒转染Huh-7细胞上调CKB的表达。通过平板克隆实验检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测CKB的mRNA表达情况；蛋白免疫印迹(Western blot, WB)实验检测CKB、p53、双微体同源基因2(mouse double minute 2 homolog, MDM2)、B淋巴瘤细胞瘤2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)和半胱天冬酶(caspase)-3蛋白表达水平。结果显示白花丹醌显著抑制Huh-7细胞增殖，诱导细胞凋亡。与对照组比较，白花丹醌组凋亡水平显著升高，而白花丹醌联合凋亡抑制剂组凋亡水平显著降低。白花丹醌可显著下调CKB、Bcl-2和MDM2蛋白表达水平，上调p53、Bax和caspase-3蛋白表达水平。敲除CKB基因后，Huh-7细胞增殖能力降低，凋亡率升高，Bcl-2和MDM2蛋白表达水平降低，p53、Bax和caspase-3蛋白表达水平升高。上调CKB表达后，Huh-7细胞增殖能力增强，Bcl-2和MDM2蛋白表达水平升高，p53、Bax和caspase-3蛋白表达水平降低。而白花丹醌可逆转过表达CKB对Huh-7细胞增殖和凋亡的作用。该实验表明，白花丹醌可显著抑制Huh-7细胞的增殖能力，其机制可能是通过抑制CKB表达，激活p53信号通路，调控线粒体相关凋亡蛋白的表达，最终诱导细胞凋亡。
2024年09期 v.49 2345-2354页 [查看摘要][在线阅读][下载 801K] [引用频次：2 ] |[下载次数：800 ] - 梁嘉敏;杨思淇;胡文浩;李旭艳;王锂韫;
探讨老鼠簕生物碱A[4-hydroxy-2(3H)-benzoxazolone, HBOA]对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。0～1.0 mmol·L~(-1 )HBOA处理体外培养的胰腺癌L3.6细胞，采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法测定细胞活力并计算半数抑制浓度IC_(50),筛选药物作用浓度和时间。利用倒置显微镜、吖啶橙(acridine orange, AO)染色观察细胞形态，活细胞计数、细胞集落形成实验检测细胞增殖、自我更新能力，流式细胞术检测细胞周期进程和细胞凋亡比率，扫描电镜观察细胞凋亡形态，qPCR检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期蛋白A(cyclinA1、cyclinA2)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2,CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21)mRNA表达，流式细胞术检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)、脂质过氧化物、线粒体膜电位水平，Western blot检测蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路活性。与对照组相比，HBOA处理组细胞活力显著下降，筛选出0.4、0.6 mmol·L~(-1 )HBOA干预48 h为后续实验剂量与时间；与对照组相比，0.4、0.6 mmol·L~(-1) HBOA处理组细胞增殖和集落形成能力被抑制，PCNA、cyclinA1、cyclinA2、CDK2 mRNA表达水平显著降低，P21 mRNA表达水平显著升高，细胞周期阻滞于S期，细胞凋亡率显著增加、出现凋亡小体，ROS水平显著升高，脂质过氧化物水平显著升高，线粒体膜电位降低，其中0.6 mmol·L~(-1)处理组显著降低，p-Akt、p-mTOR蛋白水平显著降低。该研究表明HBOA抑制胰腺癌L3.6细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与ROS增加、Akt/mTOR通路活性抑制有关。
2024年09期 v.49 2355-2363页 [查看摘要][在线阅读][下载 478K] [引用频次：2 ] |[下载次数：686 ] - 陈利;张亚军;秦洪文;胡武静;刘俨娇;肖国生;杜慧慧;杨东林;
探索柠檬精油中发挥抗肿瘤作用的活性物质以及抑制头颈癌细胞SCC15和CAL33增殖的分子机制，该研究利用噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay, MTT]鉴定出抑制头颈癌细胞增殖的活性物质为柠檬醛，并测定了柠檬醛抑制头颈癌细胞和正常细胞的IC_(50);同时，利用5-ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU)实验检测柠檬醛对头颈癌细胞增殖率的影响，通过克隆形成实验检测柠檬醛对头颈癌细胞体外肿瘤球形成的影响。通过流式细胞术检测柠檬醛对头颈癌细胞周期阻滞和凋亡诱导情况；采用蛋白印迹检测柠檬醛对头颈癌细胞周期和凋亡相关蛋白表达水平的影响。结果表明柠檬醛可有效抑制头颈癌细胞的生长增殖，具有抗肿瘤活性，其抑制CAL33和SCC15的半数抑制浓度分别为54.78、25.23μg·mL~(-1)。进一步分析发现细胞周期相关蛋白S期激酶关联蛋白2(SKP2)、原癌基因(C-MYC)、细胞周期依赖性激酶1(CDK1)、周期蛋白B(cyclin B)均呈下调趋势，细胞周期阻滞于G_2/M期。此外，柠檬醛能够促使细胞凋亡相关蛋白半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)、半胱天冬蛋白酶-9(caspase-9)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)剪切形式呈现上调趋势，而且使自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、泛素结合蛋白(P62)、自噬效应蛋白Beclin1(Beclin1)和溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)表达呈上调趋势，暗示柠檬醛诱导头颈癌细胞发生凋亡和激活自噬。利用双标质粒系统mCherry-GFP-LC3分析发现柠檬醛阻碍自噬体和溶酶体融合，使自噬流进程受阻。因此，柠檬精油中发挥抗头颈癌细胞增殖的主要活性成分是柠檬醛，该成分对头颈癌细胞具有显著的抑制作用，其分子机制可能是柠檬醛通过阻滞细胞周期，诱导细胞发生凋亡和自噬，最终抑制肿瘤细胞增殖。
2024年09期 v.49 2364-2375页 [查看摘要][在线阅读][下载 1097K] [引用频次：2 ] |[下载次数：618 ] - 曾安琪;陈雪;戴瑛;赵军宁;
非小细胞肺癌(NSCLC)中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的异常激活与远端转移、耐药、肿瘤免疫逃逸和低生存率密切相关。该研究报道了桦木酸(BA)是一种有效的mTOR信号通路抑制剂，在体外和体内对NSCLC细胞表现出有效的抗肿瘤活性。CCK-8和集落形成结果表明，BA可显著抑制H1299、A549和LLC细胞的活力和克隆生成能力。BA处理可诱导线粒体介导的H1299和LLC细胞凋亡；通过下调MMP2的表达和损害上皮-间质转化，明显抑制H1299和LLC细胞的移动性和侵袭能力。研究结果表明，BA处理可抑制mTOR信号通路，从而抑制M2表型(CD206阳性)巨噬细胞的某些方面。随后，为了评估桦木酸在LLC体内的抗肿瘤作用，利用LLC细胞建立小鼠异种移植肿瘤模型。结果表明，BA能显著延缓肿瘤的生长，抑制肿瘤细胞的增殖。更重要的是，给药BA后，肿瘤组织中M1/M2肿瘤相关巨噬细胞的比例显著升高，表明抗肿瘤免疫能力增强。综上所述，该研究结果表明，BA可通过mTOR信号通路使肿瘤相关巨噬细胞复极化，从而对NSCLC细胞具有抗肿瘤作用。
2024年09期 v.49 2376-2384页 [查看摘要][在线阅读][下载 948K] [引用频次：4 ] |[下载次数：679 ] - 张艺博;张慧中;阮意丹;张永强;张萍芝;姚爱娜;李诗曼;徐晓涵;倪健;董晓旭;
探讨重楼总皂苷诱导乳腺癌MCF-7细胞的铁死亡作用及机制，为重楼总皂苷临床治疗乳腺癌提供理论依据。通过噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)实验检测不同浓度重楼总皂苷对MCF-7细胞增殖能力的影响；倒置显微镜观察MCF-7细胞形态改变；平板克隆实验检测MCF-7细胞克隆形成能力；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放实验检测MCF-7细胞膜的完整性；划痕实验检测MCF-7细胞迁移能力；利用荧光倒置显微镜检测MCF-7细胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平，利用试剂盒检测MCF-7细胞中Fe~(2+)的含量；透射电镜观察MCF-7细胞线粒体超微结构；采用Western blot检测重楼总皂苷对MCF-7细胞中p53、溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor protein 1, TFR1)表达的影响。结果显示，1.5、3、4.5、6、7.5、9μg·mL~(-1)重楼总皂苷均能显著抑制MCF-7细胞增殖，IC_(50)为4.12μg·mL~(-1),对细胞形态有明显的损伤，导致细胞形成空泡，逐渐皱缩并脱落；抑制MCF-7细胞的克隆形成能力，破坏细胞膜促使细胞内LDH释放，缩短MCF-7细胞的迁移距离抑制迁移能力；显著提高MCF-7细胞中ROS的含量，诱导细胞氧化损伤，导致细胞内Fe~(2+)堆积，线粒体结构也发生明显的改变，线粒体膜密度增加，嵴减少甚至消失；促进p53蛋白表达，下调SLC7A11和GPX4表达并增强ACSL4和TFR1表达。因此，重楼总皂苷可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移能力、破坏细胞结构，其机制可能与诱导细胞铁死亡有关。
2024年09期 v.49 2385-2392页 [查看摘要][在线阅读][下载 473K] [引用频次：5 ] |[下载次数：1631 ]