- 袁媛;郑汉;黄璐琦;
2020年，依据现代生命科学研究成果及发展趋势，笔者课题组首次提出中药道地性可表现为道地药材具有“优形、优质、优效”(excellent shape, high quality, and superior effect,简称“三优”)特征，拓宽了传统药材辨状的范畴。近年来，随着对中药道地性自然属性、物质属性、药物属性研究的逐步深入，丰富和完善了道地药材“三优”的科学内涵。“优质”(high quality)特征主要体现为道地药材具有“独特化学型”,其可作为“优效”(superior effect)的物质基础，也可参与调控“优形”(excellent shape)的形成。与“形神合一”相似，在长期进化过程中，道地药材逐渐形成独特的环境适应性特征，表现为“形质合一”。道地药材“三优”特征受到品种基因型和产区生态因子交互作用的影响，可体现为气候主导型、生产措施主导型、种质主导型。根据道地药材自然属性、物质属性、药物属性，可构建丹参等模式生物，并建立“三优”研究方法体系，包括基于“优质”特征的质量评价体系、“性效关系”表征方法体系、基于“优形、优质”特征的稳态综合控制体系等。未来道地药材研究应更加注重深入和广泛的基础性工作，需要建立综合性的药用模式植物研究平台，并构建药用模式植物突变体库，以便为其他药用植物的功能基因研究提供有力的模式生物。同时，针对道地药材“三优”特征的研究，提出了3个热点研究方向，旨在揭示其遗传基础、生物学特性、生态适应性等方面的机制。这些研究将为优化药用植物的定向育种、规范化栽培以及提升药材质量提供科学依据，进一步推动道地药材的可持续利用和发展。
2024年15期 v.49 3977-3985页 [查看摘要][在线阅读][下载 1100K] [引用频次：6 ] |[下载次数：2199 ] - 赵雅秋;袁媛;
中药中蕴含着许多高价值活性成分，如青蒿素、紫杉醇、长春碱以及长春新碱等，但是这些中药高价值活性成分在基原植物中含量较低，结构复杂，提取和分离难度较高。为了保护有限的中药资源，研究人员采用化学全合成策略，成功制备了许多结构高度复杂的中药高价值活性成分，但是化学全合成面临苛刻的反应条件，冗长的合成路线及较低的收率等挑战。随着合成生物学的快速发展，许多中药高价值活性成分可以通过生物细胞工程制备，与化学全合成形成互补，为中药高价值活性成分的制备提供了新的策略。该文以β-榄香烯、青蒿素、丹参酮、长春新碱以及高三尖杉酯碱为例，简要梳理了代表性中药高价值活性成分的生物合成和化学合成研究进展。此外，还提出了生物合成与化学合成相结合的研究范式，包括化学酶法结构修饰中药高价值活性成分、生物合成结合半合成量产中药高价值活性成分、仿生合成助力中药高价值活性成分的生物合成途径解析等，为中药高价值活性成分合成提供重要参考。
2024年15期 v.49 3986-3997页 [查看摘要][在线阅读][下载 2325K] [引用频次：0 ] |[下载次数：1284 ] - 刘琪;虞慕瑶;韩洋;钱舒怡;邰巴达拉胡;郑汉;黄璐琦;
当植物遭受昆虫取食、极端天气及人为因素等导致的机械性损伤胁迫后，会迅速在转录及代谢水平上启动一系列的应答机制，引起植物内源激素及次生代谢物含量的变化。该研究以药用模式植物丹参为例，评估机械损伤对药用植物代谢的作用。运用qRT-PCR及LC-MS检测叶片损伤刺激下，胁迫响应的茉莉酸类物质(jasmonates, JAs)和丹参酮类成分生物合成基因以及含量的变化情况，得出处理后不同时序叶片与根部在转录和代谢水平上的相关规律，从而探讨丹参对机械损伤胁迫的响应机制。结果显示，机械损伤诱导能够瞬时提高JAs生物合成基因的表达，其中AOC与JAR在诱导后开始上升，在2 h达到最高，AOS与OPR3则在4 h达到最高，与之相应的OPDA、JA及JA-Ile的含量均在2 h达到最高。丹参酮生物合成中二萜合酶基因CPS1与KSL1均在2 h上升至最高，而后修饰CYP450s基因则均在4 h上升至最高，4种丹参酮的含量则均在8 h内呈现持续上升的趋势。该研究为揭示机械损伤对次生代谢积累的研究提供参考，为进一步了解机械损伤胁迫下JAs在增强植物抗性、促进活性成分积累和提高药材品质方面的作用奠定基础。
2024年15期 v.49 3998-4006页 [查看摘要][在线阅读][下载 1421K] [引用频次：0 ] |[下载次数：528 ] - 张雨轩;樊鑫;张敏;陈虞超;赵玉洋;焦红红;张岗;袁媛;
为探究独脚金内酯抑制剂Tis108对天麻生长的影响，该研究采用10μmol·L~(-1)的Tis108溶液处理白麻块茎，对块茎的内源激素赤霉素(GA)含量进行测定，通过RT-PCR技术克隆GA失活关键酶GeCYP714A1基因，借助ExPASy、SWISS-MODEL、MEGA等软件对该基因进行生物信息学分析，并测定其在天麻不同组织部位的表达水平。结果显示，Tis108处理后天麻块茎的GA含量显著升高，GA失活关键酶GeCYP714A1的转录水平显著降低。GeCYP714A1基因的编码区全长1 173 bp,编码390个氨基酸，蛋白的相对分子质量为44.85 kDa,理论等电点为9.83,不稳定系数为49.20,脂肪系数为89.03,总平均亲水指数平均值为-0.235,属于碱性亲水性不稳定蛋白；且GeCYP714A1蛋白定位于线粒体，无信号肽，不具有跨膜结构。系统进化树分析显示，GeCYP714A1与铁皮石斛DcCYP714C2 (PKU78454.1)蛋白亲缘关系最近，序列一致性达67.25%。利用qRT-PCR技术分析天麻GeCYP714A1基因的表达模式，结果显示在天麻块茎中GeCYP714A1转录水平最高，其次是茎和花序。该研究表明Tis108可抑制天麻块茎中GA失活酶GeCYP714A1的转录水平，提高GA的积累量，影响天麻块茎生长，为进一步揭示独脚金内酯调控天麻GA信号和块茎发育奠定基础。
2024年15期 v.49 4007-4014页 [查看摘要][在线阅读][下载 3175K] [引用频次：0 ] |[下载次数：224 ] - 池丽;韩鹏杰;焦红红;刘天睿;周骏辉;袁媛;
猪苓菌核栽培中种苓质量不稳定是影响猪苓菌核品质和产量的关键问题，该文拟对根癌农杆菌介导的猪苓遗传转化体系进行研究，为通过分子育种从而获得优质种苓提供技术保障。采用根癌农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、受体材料、侵染时间、共培养时间和筛选条件对猪苓遗传转化效率的影响，利用潮霉素抗性标记基因、特异引物PCR以及荧光检测方法筛选并检测转化子。结果表明，根癌农杆菌GV3101菌株可对猪苓菌丝进行遗传转化，菌液浓度A_(600 nm)=0.6,受体材料猪苓菌丝，侵染30 min,共培养3 d为最佳侵染条件；9μg·mL~(-1)潮霉素初筛和13μg·mL~(-1)潮霉素复筛两步筛选法为最优筛选条件。经潮霉素抗性筛选、特异引物PCR检测和荧光检测分析，结果表明外源基因eGFP已转入猪苓菌丝内整合到基因组中并成功表达，在最优条件下，转化率可达到2.3%,遗传转化周期从大于90 d缩短到小于60 d。该研究建立并优化了根癌农杆菌介导的猪苓菌丝遗传转化体系，为解析猪苓生长发育的分子机制及分子育种奠定基础。
2024年15期 v.49 4015-4021页 [查看摘要][在线阅读][下载 1130K] [引用频次：1 ] |[下载次数：623 ]
- 文武龙;张炜烨;贺雨欣;孙鑫;刘铭;于洲波;任鹏飞;梁霄;杨婧;王锐;
研究乳源性外泌体与脂质体进行膜融合得到的杂化外泌体装载青藤碱(sinomenine, SIN)后对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的治疗效果。通过蔗糖密度梯度离心法从鲜牛乳中提取外泌体，采用乳化蒸发-低温固化法制备脂质体，共孵育法进行膜融合后对杂化外泌体进行表征：透射电镜检测形貌，纳米粒度电位仪检测粒径与电位，蛋白免疫印迹法(Western blot, WB)检测膜融合前后外泌体膜表面特征蛋白CD63和TSG101的表达。超声法装载青藤碱后，酶标仪检测其载药量与包封率。胶原抗体诱导法建立CIA大鼠模型，药效实验设对照组、模型组、SIN组、SIN-脂质体组、SIN-乳外泌体组、SIN-杂化外泌体组及阳性药(地塞米松)组。记录给药期间大鼠体质量变化，以足肿胀度、免疫器官指数、关节炎指数、微循环指标变化、滑膜组织病理学检查、血清炎症因子水平变化为指标进行药效学研究。透射电镜结果显示，杂化外泌体与乳外泌体外观均呈茶托状，共孵育后外泌体粒径由(97.92±3.42)nm增长到(132.70±4.07)nm, Zeta电位由(-2.01±0.33)mV变为(-17.90±2.13)mV,WB结果显示CD63与TSG101蛋白在乳外泌体及杂化外泌体中均正常表达。酶标仪测定乳外泌体包封率31.64%±2.48%、载药量2.35%±0.52%,杂化外泌体包封率48.21%±3.12%、载药量3.17%±0.36%。药效学结果显示，与模型组相比，各给药组一般情况及足肿胀度、关节炎指数及免疫器官指数均得到显著改善(P<0.05,P<0.01),微血管综合评分及血管阻力显著下降(P<0.05,P<0.01),血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)炎症因子水平显著降低(P<0.01),滑膜组织的病变得到一定程度的改善。同时与SIN组、SIN-脂质体组及SIN-乳外泌体组相比，SIN-杂化外泌体组具备更平稳持久的药效。该研究将乳源性外泌体与脂质体共孵育得到的杂化外泌体成功改善了外泌体载药量小与脂质体生物相容性差等问题，负载青藤碱的杂化外泌体对CIA大鼠有着良好的疗效，可有效解决青风藤等疗效佳但生物半衰期短的问题，为传统中药的新发展及类风湿性关节炎等疾病的治疗提供了新思路。
2024年15期 v.49 4069-4077页 [查看摘要][在线阅读][下载 1582K] [引用频次：2 ] |[下载次数：1493 ] - 刘晓丽;欧沛思;林爱华;刘奕明;
运用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)技术及超高效液相色谱串联三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)对小柴胡颗粒化学成分及大鼠口服后的入血成分进行鉴定。采用CORTECS UPLC C~+_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.6μm),乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾离子源正、负离子模式下采集数据后与对照品比较保留时间、精确相对分子质量、二级离子碎片以及参照相关文献进行化学成分鉴别；通过皮下注射干酵母建立大鼠发热模型后，灌胃给予正常组及模型组大鼠小柴胡颗粒，给药后于不同时间点眼眶静脉取血，分离血浆，在多反应监测模式(MRM)下进行扫描鉴定入血成分。从小柴胡颗粒中共初步鉴定出112种化学成分，包括63种黄酮类、31种皂苷类、6种有机酸类、4种苯丙素类、3种氨基酸类以及5种其他类化合物；从血浆中鉴定得到18个入血原型成分。该研究鉴定了小柴胡颗粒化学成分及入血成分，为进一步的药效物质基础及质量控制研究奠定了基础。
2024年15期 v.49 4078-4090页 [查看摘要][在线阅读][下载 1289K] [引用频次：0 ] |[下载次数：2044 ] - 赵彩蓉;孟祥龙;王娟;赵泓瑜;韩香;李子昂;张朔生;
研究祖师麻及其炮制品对SD大鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)中辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)分化的影响。按体质量将64只SD大鼠随机分为正常组，模型组，祖师麻炙品低、高剂量组，生品低、高剂量组，祖师麻甲素组，雷公藤多苷组。除正常组外，CIA模型在第1次免疫后第7天进行二免，并在二免7 d后灌胃28 d。取材后，采用苏木素-伊红(HE)染色观察CIA大鼠关节滑膜炎症的情况；采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中转化生长因子-β(TGF-β)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10水平变化；实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测关节滑膜中分化簇80(B7-1)、分化簇86(B7-2)、分化簇28(CD28)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)mRNA和蛋白表达；流式细胞术用于检测大鼠关节滑膜中Th17和Treg细胞的比例。结果显示，与正常组相比，模型组大鼠的关节滑膜炎症明显加剧，关节炎指数评分明显上升，免疫器官指数上升(P<0.01);与模型组相比，各给药组均能不同程度地改善大鼠的关节炎症，降低关节评分指数，抑制滑膜增生，降低免疫器官指数；相较于模型组，各给药组中大鼠血清中IL-2、IFN-γ显著下降(P<0.01),TGF-β、IL-4、IL-10显著上升(P<0.01),滑膜中B7-1、CTLA-4 mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),关节组织中的Th17细胞和Treg细胞的比例出现显著降低(P<0.01)。综上得出祖师麻通过调控B7/CD28/CTLA-4通路以及调节Th17/Treg平衡，抑制CIA大鼠中Th17细胞的表达，促进Treg细胞的表达，进而治疗RA。
2024年15期 v.49 4091-4099页 [查看摘要][在线阅读][下载 2882K] [引用频次：0 ] |[下载次数：598 ]
- 宋玮;张钟艺;张小波;沈涛;
旨在探讨茱萸丸对动脉粥样硬化(AS)的影响及可能的作用机制。采用高脂饲料喂养诱导小鼠AS模型，造模周期为12周。造模成功的50只载脂蛋白E基因敲除(ApoE~(-/-))小鼠按照随机数字表法分为5组，即模型组，茱萸丸低、中、高剂量组，阿托伐他汀钙组，每组10只；C57BL/6J小鼠10只作为空白组。空白组及模型组给予等体积无菌蒸馏水灌胃，茱萸丸低、中、高剂量组给予130.54、261.08、522.16 mg·kg~(-1)灌胃，阿托伐他汀钙组给予10.40 mg·kg~(-1)灌胃，每日1次，共12周。给药结束后，采用苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠主动脉、肝脏、附睾脂肪的病理学变化，并计算主动脉斑块面积占比、附睾脂肪面积、非酒精性脂肪肝活动性积分(NAS);油红O染色、Masson染色观察主动脉脂质及胶原纤维沉积，并计算主动脉红染脂质面积占比、主动脉胶原沉积面积占比；比色法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、铁离子水平；免疫荧光法检测主动脉环氧合酶2(COX2)、铁蛋白重链1(FTH1)、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白水平；免疫组化法检测主动脉肿瘤蛋白53(p53)水平；蛋白免疫印迹法检测主动脉p53、SLC7A11蛋白表达；实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测小鼠主动脉p53、SLC7A11、GPX4、FTH1、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)mRNA表达水平。结果显示，与空白组比较，模型组小鼠主动脉斑块面积明显扩大，胶原纤维沉积增加，肝脏脂质沉积增加，脂滴变多，附睾脂肪细胞体积扩大；血清中铁离子、MDA含量升高，SOD、GSH-Px水平降低；p53、COX2蛋白表达升高；主动脉FTH1、SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA表达降低；PTGS2、NOX1 mRNA表达升高。与模型组比较，茱萸丸低、中、高剂量组及阿托伐他汀钙组小鼠主动脉斑块面积明显缩小，胶原沉积减少，肝脏脂质沉积减少，脂滴变少，附睾脂肪细胞体积缩小；血清中铁离子、MDA含量降低，SOD、GSH-Px水平升高；p53、COX2蛋白表达降低；主动脉FTH1、SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA表达升高；PTGS2、NOX1 mRNA表达降低。综上所述，茱萸丸对小鼠AS主动脉斑块具有较好的治疗作用，其机制可能与调控p53/SLC7A11信号通路介导的氧化损伤及抑制细胞铁死亡有关。
2024年15期 v.49 4118-4127页 [查看摘要][在线阅读][下载 1997K] [引用频次：4 ] |[下载次数：1718 ] - 张钦钦;张贝贝;杨帆;王茜;薛淑娟;布晨希;吴给给;陈随清;
从药效相关性和成分差异阐释青翘与老翘改善博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的作用差异。小鼠随机分为正常组，模型组，吡非尼酮组(50 mg·kg~(-1)),青翘低、高剂量组(1.3、2.6 g·kg~(-1)),老翘低、高剂量组(1.3、2.6 g·kg~(-1))。采用气管滴注BLM制备肺纤维化模型，统计小鼠存活率及体质量变化；给药完成后计算肺指数，HE染色、Masson染色和天狼星红染色评价肺组织病理变化；透射电子显微镜观察肺组织超微结构；生化法测定肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏着蛋白(E-cadherin)、羟脯氨酸(HYP)及肺泡灌洗液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平；RT-qPCR、Western blot法检测肺组织中基质金属蛋白酶7(MMP7)、胶原蛋白Ⅰ型(collagenⅠ)、E-cadherin、TNF-α、波形蛋白(vimentin)、TGF-β1、α-SMA表达；免疫荧光检测肺组织中α-SMA的表达；主成分分析法评价老翘与青翘改善肺纤维化的作用差异；分子对接技术分析老翘中含量高的化合物与TGF-β1受体之间的相互作用，CCK-8法检测其对TGF-β1诱导BEAS-2B和HFL1细胞模型的影响。结果显示，青翘、老翘可提高肺纤维化小鼠存活率，降低肺指数，改善肺组织病理损伤与胶原纤维沉积水平，改善小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞板层小体受损情况，降低肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α水平，下调肺组织中HYP、MMP7、vi-mentin、collagenⅠ、TGF-β1、α-SMA的表达，上调E-cadherin的表达。通过主成分分析综合评价胶原纤维沉积水平，其改善程度为老翘高剂量>老翘低剂量>青翘高剂量>青翘低剂量。分子对接显示羟基酪醇、咖啡酸、连翘脂素、落叶松脂素与TGF-β1受体有较好的结合活性，且可显著减轻TGF-β1诱导BEAS-2B细胞损伤，抑制TGF-β1诱导HFL1细胞增殖。综上，青翘、老翘均可有效改善BLM诱导的肺纤维化小鼠损伤，老翘在减少胶原沉积方面优于青翘，可能与老翘中羟基酪醇、咖啡酸、连翘脂素、落叶松脂素含量高于青翘有关。
2024年15期 v.49 4128-4138页 [查看摘要][在线阅读][下载 3415K] [引用频次：0 ] |[下载次数：1145 ] - 卜明;任文康;王璐;孙春雪;罗然;郭晓珊;林宇;葛鹏玲;刘吉成;
研究过氧麦角甾醇线粒体靶向衍生物(Mito-EP)对乳腺癌的影响及作用机制。采用MTT法检测不同浓度Mito-EP(0、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4μmol·L~(-1))作用于MDA-MB-231细胞后增殖抑制情况。将实验分为空白对照组，低、中、高浓度(0.15、0.3、0.6μmol·L~(-1))Mito-EP组及过氧麦角甾醇(EP)0.6μmol·L~(-1)组，培养48 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡率、活性氧水平、线粒体膜电位变化以及细胞周期分布，并在激光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡、细胞活性氧及细胞线粒体膜电位变化；通过构建4T1皮下移植瘤模型体内验证Mito-EP对乳腺癌的抑制作用；采用Western blot法检测细胞及肿瘤组织内B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt C)、cleaved caspase-7、cleaved caspase-9蛋白表达水平。结果表明，Mito-EP可呈浓度依赖性地降低MDA-MB-231细胞增殖率；与空白对照组相比，EP 0.6μmol·L~(-1)组细胞凋亡率、活性氧水平、线粒体膜电位变化不明显。与空白对照组相比，Mito-EP处理组细胞凋亡率明显增加(P<0.05);活性氧水平明显升高(P<0.05);线粒体膜电位明显降低(P<0.05);Bax、Cyt C、cleaved caspase-7、cleaved caspase-9蛋白表达显著上调，Bcl-2蛋白表达显著下调(P<0.05);肿瘤体积和质量明显减小。综上所述，Mito-EP可能通过激活线粒体凋亡途径促进乳腺癌细胞凋亡。
2024年15期 v.49 4139-4147页 [查看摘要][在线阅读][下载 1933K] [引用频次：0 ] |[下载次数：550 ] - 姚冰;刘靖雷;王孟清;罗银河;谢静;荀春铮;李凡;黄婷;曾庆佳;
探讨五虎汤治疗呼吸道合胞病毒(RSV)诱发哮喘的效应物质及作用机制。使用超高效液相串联高分辨质谱仪确定五虎汤的入血成分；借助数据库对入血成分作用于哮喘的靶点进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析及基因本体论(GO)功能分析。同时将靶点蛋白及代谢物-靶点-通路等信息导入STRING数据库，构建蛋白互作网络，明确五虎汤核心成分及关键通路。体内实验部分使用RSV联合鸡卵清蛋白(OVA)建立哮喘模型，通过肺功能、苏木精-伊红(HE)染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、蛋白免疫印迹法及免疫组织化学法验证五虎汤对RSV诱导哮喘小鼠的干预作用。结果显示，五虎汤入血成分以黄酮类、苯丙素类、木脂素类、萜类等化合物为主，作用于儿童哮喘的核心成分有(-)-表没食子儿茶素、山柰素、异甘草素、香叶木素、桦木酸、熊果酸、瑞香素、七叶素等，钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、NOD样受体信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路等是其靶点主要作用通路。体内实验结果表明，五虎汤能够改善肺功能指标，下调白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17((IL-17)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，并且能够降低肺组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、核因子-κB亚基1(NFKB1)等蛋白的表达，减轻中性粒细胞炎症浸润及肺淤血。结果表明，五虎汤通过多组分、多靶点、多途径的协同作用干预病毒诱发哮喘，体内实验证明其能抑制NOD样受体信号通路的激活，减轻哮喘小鼠气道炎症与气道损伤。
2024年15期 v.49 4148-4157页 [查看摘要][在线阅读][下载 3174K] [引用频次：2 ] |[下载次数：2602 ] - 叶婷;高航;葛洋;沈瑞;余鸿雁;陈峰远;宋航;
基于蛋白组学探讨灵芝酸X(ganoderic acid X, GAX)对人肝母细胞瘤HepG2、HuH6细胞模型和非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic-severe combined immune deficient, NOD-SCID)小鼠皮下移植瘤模型的作用机制，为灵芝酸X的临床应用提供依据。采用CCK-8法检测灵芝酸X对HepG2、HuH6细胞活力的影响；EdU实验检测灵芝酸X对细胞增殖的影响；划痕实验检测灵芝酸X对细胞迁移能力的影响；Hoechst 33258染色检测灵芝酸X对细胞凋亡的影响；建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型，分析对照组及灵芝酸X低、中、高剂量组(5、10、20 mg·kg~(-1))肿瘤体积和质量；苏木素-伊红(HE)染色评估灵芝酸X的药物毒性。此外，收集HepG2细胞对照组和灵芝酸X高剂量组的细胞，分别进行laber-free蛋白组学分析，筛选差异蛋白并富集相关信号通路，CYTO-ID?染色检测细胞自噬情况，Western blot实验检测相关蛋白的表达量。体外结果显示，灵芝酸X呈剂量依赖性抑制HepG2、HuH6细胞的增殖、迁移、诱导凋亡；体内研究显示灵芝酸X显著抑制肿瘤体积和质量，且对小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)无明显损害；laber-free蛋白组学结果显示灵芝酸X在肝母细胞瘤治疗过程中参与多种信号通路，其中自噬途径高度富集。CYTO-ID?染色及Western blot结果显示灵芝酸X诱导细胞自噬并上调苄氯素1(Beclin-1)、自噬相关基因5(ATG5)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白表达量，下调螯合体1(p62)蛋白表达量。该研究表明，灵芝酸X通过诱导自噬进而抑制肝母细胞瘤细胞的增殖、迁移和诱导凋亡，并显著抑制肿瘤生长，是一种有希望的癌症辅助治疗药物。
2024年15期 v.49 4158-4166页 [查看摘要][在线阅读][下载 2865K] [引用频次：2 ] |[下载次数：739 ] - 孙小敏;吴倩;汪宁;
该研究基于线粒体铁蛋白(ferritin mitochondrial, FtMt)抑制铁死亡探讨藁本内酯(ligustilide, LIG)减轻氧糖剥夺/复糖复氧(oxygen and glucose-deprivation/reoxygenation, OGD/R)诱导小鼠海马神经元细胞(HT22)损伤的作用及机制。体外建立OGD/R诱导HT22细胞损伤的模型，HT22细胞随机分为正常组，模型组，LIG 5、10、20μmol·L~(-1)组，铁死亡抑制剂(ferrostatin-1,Fer-1,2μmol·L~(-1))组。CCK-8法检测细胞活力，LDH试剂盒检测乳酸脱氢酶释放量，倒置显微镜观察HT22细胞形态，透射电镜观察线粒体的超微结构，化学发光法检测细胞内Fe~(2+)含量。为进一步探究FtMt抑制铁死亡的机制，沉默HT22细胞的FtMt,并随机分为正常组、模型组、20μmol·L~(-1)LIG组、si-NC组、si-FtMt组、si-FtMt+20μmol·L~(-1)LIG组。免疫荧光和Western blot法检测FtMt的表达，化学发光法检测HT22细胞内NADPH/NADP~+、GSH、MDA、ATP的含量，激光共聚焦观察mtROS荧光强度，流式细胞术检测细胞内Fe~(2+)含量，Western blot法检测铁死亡相关蛋白Ferrtin、GPX4、ASCL4的表达。研究结果表明，与模型组相比，LIG可以显著提高HT22细胞存活率，改善损伤的HT22细胞形态及线粒体超微结构，降低细胞内Fe~(2+)含量和降低促铁死亡蛋白ACSL4的表达，增加抗铁死亡蛋白Ferrtin、GPX4的表达。沉默FtMt后，LIG促进FtMt的表达；与si-FtMt组相比，LIG可以显著提高NADPH/NADP~+、GSH含量，降低mtROS的荧光强度、MDA含量，提高ATP活性，降低HT22细胞内Fe~(2+)含量，抑制促铁死亡蛋白ACSL4的表达，提高抗铁死亡蛋白Ferrtin、GPX4的表达。综上，LIG通过上调FtMt的表达改善线粒体功能抑制铁死亡，从而减轻OGD/R诱导HT22细胞损伤。
2024年15期 v.49 4167-4177页 [查看摘要][在线阅读][下载 2241K] [引用频次：0 ] |[下载次数：1089 ] - 丁芮;李向阳;王翔;王靓;周鹏;黄金玲;
该研究旨在通过观察苓桂术甘汤(Linggui Zhugan Decoction, LGZGD)含药血清对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)纤维化及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白分子表达的调控机制。制备空白血清和LGZGD含药血清，胰酶-胶原酶依次消化并结合差速贴壁法分离培养原代CFs,采用免疫荧光标记鉴定原代CFs。设正常对照组，模型组，20%空白血清组，5%、10%、20%LGZGD含药血清组。分别用20%空白血清，5%、10%、20%LGZGD含药血清预处理12 h,除正常对照组，其余5组均加入过氧化氢(hydrogen peroxide, H_2O_2)刺激细胞，建立原代CFs纤维化模型。采用划痕愈合实验观察细胞迁移能力，ELISA法检测Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ,ColⅢ)含量，Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Wnt1、糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta, GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶3β(phospho synthase kinase 3 beta, p-GSK-3β)、β-catenin及细胞核β-catenin的蛋白表达，RT-qPCR检测β-catenin、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)的基因表达，免疫荧光技术检测关键蛋白α-SMA、β-catenin的表达及定位。制备Wnt1过表达CFs,采用H_2O_2处理CFs。设正常对照组、模型组、20%LGZGD含药血清组、空载质粒+20%LGZGD含药血清组、Wnt1过表达+20%LGZGD含药血清组。采用ELISA法检测ColⅠ、ColⅢ的含量与其比值，Western blot法检测α-SMA和Wnt1、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及细胞核β-catenin的蛋白表达，RT-qPCR检测β-catenin、MMP9的基因表达。免疫荧光染色显示，心肌成纤维细胞Vimentin表达阳性，呈绿色，胞核为蓝色，纯度大于90%,鉴定是原代CFs。结果显示，与正常对照组相比，模型组CFs愈合率增强，ColⅠ、ColⅢ含量升高，ColⅠ/ColⅢ比值增大，α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核β-catenin蛋白表达上调，GSK-3β蛋白表达降低，β-catenin、MMP9 mRNA表达显著升高，β-catenin、α-SMA荧光强度明显增强，表达量明显增多；与模型组相比，5%、10%、20%LGZGD含药血清能显著抑制细胞迁移能力，减少ColⅠ、ColⅢ的含量，降低ColⅠ/ColⅢ比值，下调α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核β-catenin蛋白表达，提高GSK-3β表达，减少β-catenin、MMP9的mRNA表达，降低β-catenin、α-SMA荧光强度和表达量；与空载质粒+20%LGZGD含药血清组比，过表达Wnt1后，LGZGD作用被显著逆转。LGZGD能够减少胶原纤维过度沉积，抑制成纤维细胞过度增生，改善心肌纤维化进程。LGZGD改善心肌纤维化的作用与调控Wnt/β-catenin通路，减少胶原沉积，保护心肌细胞有关。
2024年15期 v.49 4178-4187页 [查看摘要][在线阅读][下载 1752K] [引用频次：2 ] |[下载次数：819 ] - 田晓玲;张彧;杜珊;伍梦思;谭年花;陈斌;
基于肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信号轴研究赤芍-附子药对对慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)大鼠的治疗作用及对肝细胞再生的影响。采用牛血清白蛋白皮下及尾静脉注射联合脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)+D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)腹腔注射构建ACLF大鼠模型，实验设置正常对照(NC)组、模型(vehicle)组、赤芍-附子药对(SFYD,5.85 g·kg~(-1))组、促肝细胞生长颗粒(HGFG,4.05 g·kg~(-1))组。苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色观察大鼠肝组织病理变化。全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(alanineamino transferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transa-minase, AST)、总胆红素(total bilirubin, TBIL)。ELISA法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)炎症因子水平。免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞增殖相关抗原(antigen identified by monoclonal antibody, Ki67)及细胞周期蛋白(cell cycle protein B1, CyclinB1)阳性表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测HGF、结合蛋白Gab1(grb2 associated binding protein 1, Gab1)、PI3K、Akt、磷酸化PI3K(phosphorylation PI3K, p-PI3K)、磷酸化Akt(phosphorylation Akt, p-Akt)mRNA及蛋白表达水平。结果显示，与vehicle组比较，SFYD组大鼠肝组织病理评分降低，肝功能及炎症反应改善，PCNA、Ki67、CyclinB1荧光表达增强。同时与模型组相比，SFYD组HGF、Gab1蛋白表达上调，PI3K、Akt磷酸化激活。以上研究表明赤芍-附子药对通过减轻肝细胞炎症损伤以及促进肝细胞再生来达到抗肝衰竭的效应，其具体调控机制可能与激活HGF/PI3K/Akt信号通路有关。
2024年15期 v.49 4188-4196页 [查看摘要][在线阅读][下载 1563K] [引用频次：1 ] |[下载次数：892 ] - 张修红;傅开龙;林侃;李楠;姚明龙;郑关毅;
为探讨补阳还五汤抗大鼠脑缺血再灌注损伤的机制，180只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、补阳还五汤+miR-26a-5p激动剂(激动剂)组、补阳还五汤+激动剂阴性对照(激动剂阴性对照)组，每组36只；每组又按再灌注时间分为第3、7、14天3个亚组。除假手术组外，其余各组采用线栓法诱导大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，缺血90 min后再灌注。补阳还五汤组、激动剂组、激动剂阴性对照组建模24 h后开始给予补阳还五汤灌胃，每日2次；假手术组、模型组灌胃等量生理盐水，直至处死的前1 d。激动剂组和激动剂阴性对照组建模24 h后分别于侧脑室注射miR-26a-5p激动剂和miR-26a-5p激动剂阴性对照剂，其他各组注射等量生理盐水。各组建模24 h后腹腔注射5-溴脱氧尿苷(BrdU),每日1次，直至处死的前1 d。采用改良版神经损伤严重程度评分(mNSS)评价神经功能缺损，2,3,5-三苯四氮唑(TTC)染色检测脑梗死体积，TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡，免疫荧光双标记法检测BrdU/NeuN双阳性(BrdU~+/NeuN~+)细胞数评估新生神经元，双荧光素酶实验验证PTEN是miR-26a-5p的靶基因，实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测PTEN及miR-26a-5p的表达，蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表达。结果显示，与模型组比较，补阳还五汤可促进脑缺血大鼠神经功能恢复，缩小脑梗死体积，增加BrdU~+/NeuN~+细胞数，上调miR-26a-5p的表达，调控PTEN/PI3K/Akt信号通路，促进神经元新生；侧脑室注射miR-26a-5p激动剂后加强上述效应。综上所述，补阳还五汤可促进脑缺血大鼠神经功能恢复，减小脑梗死体积，促进脑缺血大鼠神经元新生，其机制可能是通过miR-26a-5p激活PTEN/PI3K/Akt信号通路。
2024年15期 v.49 4197-4206页 [查看摘要][在线阅读][下载 2123K] [引用频次：5 ] |[下载次数：1008 ] - 谭丽;龙江兰;曾志华;高慧娟;艾菲拉·艾克帕尔;张建文;王威;孟醒;林宇涵;孙超凡;袁宇莲;王春潺;陈元昊;令国兴;唐煜;冯兴中;
为探析黄芪四妙汤(Huangqi Simiao Decoction, HSD)治疗2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的作用机制。通过网络药理学筛选HSD的成分靶点及T2DM相关疾病靶点，构建交集靶点的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络、药物-成分-交集靶点网络，并筛选出潜在活性成分及靶点；使用AutoDock Vina软件进行分子对接验证潜在成分与核心靶点的相互作用；通过超高效液相色谱-串联质谱代谢组学技术检测血清，采用主成分分析(PCA)及偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)等多元统计分析，结合MetaboAnalyst数据库寻找各组差异代谢物与相关代谢通路，并将筛选的差异代谢物结合网络药理学筛选的交集靶点联合分析相同代谢通路。网络药理学显示，HSD治疗T2DM的9个核心成分为槲皮素、山柰酚、豆甾醇、汉黄芩素、β-谷甾醇、黄藤素、黄连素、黄连碱、小檗红碱；5个核心靶点为AKT1、TP53、TNF、IL6、VEGFA。分子对接显示，核心成分和靶点基因结合较好。代谢组学显示，共鉴定出112个共同差异代谢物，经HSD治疗后，其中88个代谢物浓度上升，24个代谢物下降。富集分析表明，HSD调节T2DM患者机体代谢主要与氨基酸代谢、三羧酸循环等7条代谢通路有关。代谢组学与网络药理学联合分析显示，二者均涉及组氨酸代谢通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路。结果表明，HSD对T2DM具有较好的治疗作用，基于代谢组学和网络药理学分析发现其作用机制可能是HSD中槲皮素、山柰酚、豆甾醇等药效基础通过调控多种代谢物，加强对组氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢通路的影响，为进一步防治T2DM提供了依据。
2024年15期 v.49 4207-4219页 [查看摘要][在线阅读][下载 2722K] [引用频次：2 ] |[下载次数：2884 ]